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ELISA试剂盒根据实验条件的不同而进行选择

  ELISA试剂盒的试验原理:
  ELISA试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验(ELISA).已知浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将生物素标记的抗体同时温育。洗涤后,加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤,去除未结合的酶结合物,然后加入底物A、B,和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中的浓度呈比例关系。
 
  完整的ELISA试剂盒包含以下各组分:
  1、已包被抗原或抗体的固相载体(免疫吸附剂);
  2、酶标记的抗原或抗体(结合物);
  3、酶的底物;
  4、阴性对照品和阳性对照品(定性测定中),参考标准品和控制血清(定量测定中);
  5、结合物及标本的稀释液;
  6、洗涤液,在板式ELISA中,常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸缓冲盐水;
  7、酶反应终止液,常用的HRP反应终止液为硫酸,其浓度按加量及比色液的终体积而异,在板式ELISA中一般采用3mol/L。
 
  ELISA试剂盒实验条件的选择:
  在ELISA试剂盒中,进行各项实验条件的选择是很重要的,其中包括:
  1、固相载体的选择:许多物质可作为固相载体,如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体,在使用前均可进行筛选:用等量抗原包被,在同一实验条件下进行反应,观察其显色反应是否均一性,据此判明其吸附性能是否良好。
  2、包被抗体(或抗原)的选择:将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时,要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0~9.6之间。吸附温度,时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃18~24小时。蛋白质包被的适浓度需进行滴定:即用不同的蛋白质浓度进行包被后,在其它试验条件相同时,观察阳性标本的OD值。选择OD值大而蛋白量少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1~10μg/ml。
  3、酶标记抗体工作浓度的选择:首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定。然后再固定其它条件或采取“方阵法”在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。
  4、酶的底物及供氢体的选择:对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应,而本身无色。有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用,应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体,如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后,应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间,以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制,尤其是H2O2在临用前加入。
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