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Klenow 片段 (3´→ 5´ exo-)

简要描述:

Klenow 片段 (3´→ 5´ exo-)Klenow 片段(3´→5´exo-)是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的蛋白水解产物。它保留了DNA 聚合酶活性,但失去了 5´→3´ 外切核酸酶活性。该酶经突变(D424A)去除了其 3´→5´ 的外切核酸酶活性。
具体有下列特点:
1. 用随机引物制备探针

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Klenow 片段 (3´→ 5´ exo-)

200U

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Klenow 片段(3´→5´exo-)是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的蛋白水解产物。它保留了DNA 聚合酶活性,但失去了 5´→3´ 外切核酸酶活性。该酶经突变(D424A)去除了其 3´→5´ 的外切核酸酶活性。
具体有下列特点:
1.  用随机引物制备探针
2.  随机引物Klenow 片段 (3´→ 5´ exo-)标记法
3.  合成 cDNA 第二链
4.  诱变反应中第二链的合成
5.  双脱氧法 DNA 序列测定(Sanger 法)
RNA提取法:试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚,其中异硫氰酸胍可裂解细胞,促使核蛋白体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中。当加入氯时,它可抽提酸性的苯酚,而酸性苯酚可促使RNA进入水相,Klenow 片段 (3´→ 5´ exo-)离心后可形成水相层和有机层,这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层(无色)主要为RNA,有机层(黄色)主要为DNA和蛋白质。
实验步骤:
1、RNA的提取;
2、反转录合成cDNA;
3、PCR扩增;
4、产物的电泳和结果的测定。
RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA,再以cDNA为模板,扩增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中,每一步都在zui条件下进行。
碱变性提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离,当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH至中性时,变性的质粒DNA又恢复原来的构型,保存在溶液中,而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构,通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
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